6. Identifikace původců infekčních nemocí


Obr. 6.1 Organismus definovaný dvěma vlastnostmi může být zařazen do některé ze skupin t1 – t4 v rovině (A). Třetí vlastnost vyžaduje třetí dimenzi za vzniku kostky a podobně je to pro další vlastnosti. Pro převedení multidimenzionálních vztahů mezi taxony do roviny musí být použita nějaká shlukovací (klastrovací) metoda (B) nebo 3D prostor. Příkladem shlukovací (klastrovací) metody je single linkage method, kdy dva nejblíže ležící taxony (např. druhy) tvoří shluk a jeho podobnost k jiným shlukům je vyjádřena na grafu procentem podobnosti (B).



Obr. 6.2 Biochemická identifikace: inokulum čisté bakteriální kultury je resuspendováno ve fyziologickém roztoku a inokulováno do zkumavek nebo jamek s kultivačním médiem, které obsahuje určité substráty (nejčastěji sacharidy). V tomto našem případě může být u 8 bakteriálních izolátů testováno 12 vlastností. Bakterie metabolizující substrát (např. oxidací nebo fermentací) obvykle v průběhu kultivace přes noc při 37 °C mění pH půdy a pH indikátor mění její zabarvení, což znamená pozitivní reakci. Biochemický profil se srovnává s biochemickými vlastnostmi jednotlivých druhů nebo se srovnání provede pomocí softwaru.



Obr. 6.3.A Postup přípravy vzorků pro metodu MALDI-TOF/MS:
1. Odběr bakteriální kolonie z kultury narostlé na kultivační půdě; 2. Nanesení bakteriální kolonie na pevný nosič s následným nanesením UV-absorbující matrice, která absorbuje většinu energie v průběhu nanosekundového laserového pulsu, a tak zabrání fragmentaci analyzovaných biomolekul, které ale pořád mohou procházet do ionizovaného plynu.



Obr. 6.3.B Princip metody MALDI-TOF/MS:
Hmotnostní spektrometrie nejdříve biomolekuly ionizuje, potom separuje a nakonec měří čas letu, vytváří hmotnostní spektrum a nakonec srovnáním s databází známých hmotnostních spekter identifikuje studovaný mikroorganismus.
1. laser; 2. vyšetřovaný vzorek nanesený na kovové destičce; 3. uzemněná mřížka s elektrickým polem; 4. trubice detektoru doby letu s vakuem; 5. detektor doby letu; 6. ionizované molekuly vzorku (červené) a matrice (žluté); 7. rozdělení urychlených částic podle rychlosti (čím větší částice, tím pomalejší let).



   

Obr. 6.4 Specifická hmotnostní spektra klinických izolátů Escherichia coli (A) a Enterococcus faecalis (B) (analýza: Karel Bubeníček, Ústav lékařské mikrobiologie, 2. lékařská fakulta, Karlova univerzita, Praha)



Obr. 6.5 PYR A test na průkaz pyrrolidonylarylamidázy u Streptococcus pyogenes



Obr. 6.6 Screeningové testy pro rodovou identifikaci grampozitivních aerobních koků



Obr. 6.7 Amplikon citrátsyntázového genu Bartonella henselae (A2) a jeho restrikční profil (A1); amplikon Anaplasma phagocytophilum (B1) a pozitivní (B2) a negativní kontrola (B3). Bakteriální izolát s touto sekvencí genu pro 16S rRNA (C) byl identifikován jako S. aureus