11.Molekulární mikrobiologie a epidemiologie


Obr. 11.1 Transpeptidáza PBP2 u kmenů S. aureus propojuje disacharidový polymer (NAG, N-acetylglukosamin, NAM – N-acetylmuramová kyselina) do komplexní sítě buněčné stěny pomocí aminokyselin (tetrapeptidy tvoří postranní řetězce a přemostění mezi nimi pentapeptid glycin). Betalaktamy se strukturálně podobají terminálnímu konci tetrapeptidu, navážou se na PBP proteiny a zamezí tak propojení aminokyselin a „zesíťování“ buněčné stěny. Díky alternativnímu PBP2a u kmenů MRSA dochází k propojování peptidů navzájem i v přítomnosti betalaktamů. TP – transpeptidační enzymatická reakce.



Obr. 11.2 Ani dnes není známý původ genu mecA kazety SCCmec. Má se za to, že k inzerci této kazety na chromozom citlivého kmene S. aureus došlo dosud pouze několikrát. Proto dodnes je známo pouze několik kmenů MRSA, které se rozšířily prakticky po celém světě.



Obr. 11.3 Geny mecR1 a mecI leží v těsné blízkosti genů mecA na chromozomu stafylokoka. Gen mecR1 kóduje membránový signální protein MecR1 a gen mecI regulátor transkripce MecI. Mezi mecA a mecR1 jsou promotory genů a operátor. MecR1 and MecI mají vysokou sekvenční podobnost s proteiny BlaR1 a BlaI, které se podílejí na inducibilní expresi plazmidového stafylokokového genu blaZ. Uspořádání genů pro BlaR1 a BlaI se podobá systému u mecA, což nasvědčuje tomu, že tyto regulační geny mohly být získané v minulosti ze systému blaZ. Oblasti operátora jsou podobné natolik, že umožňují, aby BlaI reguloval expresi PBP2a. BlaR2 je protein, u kterého se předpokládá, že způsobuje proteolýzu BlaI nebo MecI. A) represe transkripce blaZ (mecA) a blaR1-blaI (mecR1-mecI) pomocí proteinu BlaI (MecI). B) indukce syntézy betalaktamázy v přítomnosti betalaktamového antibiotika – pomocí aktivovaného proteinu MecR1 nebo BlaR1 a proteinu BlaR2 dochází k degradaci MecI a BlaI.



Obr. 11.4 Procedura makrorestrikční analýzy DNA pomocí pulzní elektroforézy (schematicky). Čistá kultura je promíchána v rozpuštěné agaróze. Inokulum je nakapané na podložní sklíčko. Po zatuhnutí agarózy se pomocí detergentu bakteriální buňky v disku lyzují, proteinázou se odstraní proteiny a restriktázou se specificky štěpí chromozom. Pulzní elektroforézou lze od sebe odlišit i velké kusy DNA (až několik set bp) na rozdíl od konvenční elektroforézy. DNA se izoluje v agaróze, aby v průběhu její izolace nedošlo střižnými silami při pipetování k fragmentaci DNA a vzniku nečitelných profilů se silným pozadím.



Obr. 11.5 Multilokusová sekvenační analýza (multilocus sequence typing – MLST) mapuje několik interních fragmentů DNA (obvykle dlouhých 450–500 bp) z lokusů "metabolických" genů bakterií (obvykle sedm). Změna např. v jediném nukleotidu již reprezentuje jinou alelu. Každý sekvenační typ (ST) je označený jako kombinace alel (alelický profil).



Obr. 11.6 Analýza nemocničních kmenů MRSA v České republice (2000–2002). Sto kmenů bylo analyzováno kombinací molekulárních typizačních metod, se kterými v kombinaci s anamnestickými a klinickými údaji bylo možné sledovat introdukci a cirkulaci klonů MRSA v českých nemocnicích.